文献分享 | miRNA+CRISPR系统=细胞特异性基因编辑工具

期刊：Nature Cell Biology

作者：Wang XW, Hu LF, Hao J, et al.

发表日期：2019年4月

IF：17.728

研究概括：本文研究人员成功设计了由细胞类型特异性miRNA或siRNAs激活CRISPR-Cas9平台的系统，该系统实现了对CRISPR基因编辑系统的精准控制，有望增强相关基因编辑技术在疾病治疗过程中的安全性和有效性。

背景介绍

1、miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其长度约为18~25个核苷酸，通常被装载进AGO蛋白中，形成一个诱导RNA沉默的效应复合物(RISC)。通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。有研究发现，miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡等，并且许多miRNA在特定的组织或细胞类型中表达，其表达量随着不同的表达环境或者不同的疾病阶段而发生动态变化。理论上，这种高度特异性信息可以被用来标记或者操控特定细胞中报告基因或者内源基因的特异性表达，以及反映细胞分化过程或疾病发生。然而，目前尚未有报道能够实现对于miRNA的活性及其对靶基因的调控的监测。

2、原核生物的一种免疫系统--II型规律成簇短回文重复序列系统（Type II CRISPR/ Cas9），主要用来抵抗外源遗传物质的入侵。其工作原理与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理相似，CRISPR/Cas系统通过识别外源DNA，并将其切断，从而沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，近年来，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具，并对疾病治疗、农作物育种等多方面的研究具有重要意义。然而，如何精确地发挥特定类型细胞中CRISPR系统的基因编辑作用仍等待更多研究。

3、北京大学分子医学研究所的汪阳明老师课题组经过不断的研究和验证发现，可以利用细胞特异性miRNA调控特定类型细胞中CRISPR系统的开启，调控内源基因的表达；利用CRISPR系统的作用产物反映miRNA活性，从而实现对不同细胞中特异性miRNA活性的监测。即miRNA诱导开启的CRISPR-Cas9平台可作为miRNA活性的传感器和细胞类型特异性基因组的调控工具。

研究内容

1. miRNA诱导的CRISPR-Cas9平台的设计

研究人员设计了一个由miRNA诱导开启的CRISPR-Cas9平台，即MICR的体系。CRISPR-Cas9 基因编辑系统分为两个部分：一个是结合不同效应子的Cas9/dCas9蛋白(Cas9蛋白具有识别和核酸酶作用，dCas9蛋白只识别指定序列，但不发生剪切)，执行基因编辑或控制基因表达的任务；另一个是sgRNA，介导Cas9蛋白质在基因组特定位置的结合。研究人员设计了具有miRNA结合位点的没有活性的sgRNA前体(pre-sgRNA)(图a)，使得只有在特定miRNA表达的细胞中，通过miRNA对pre-sgRNA的剪切形成成熟的具有功能性的sgRNA，继而引导CRISPR系统启动基因编辑工作。

2. 利用MICR-荧光报告基因平台验证MICR可行性

研究人员将表达dCas9-VPR（融合转录激活因子的dCas9）、pre-sgRNA、红荧光蛋白基因(RFP)(图b)的质粒转染到两种小鼠胚胎干细胞(ESCs)V6.5及Dgcr8−/−中，其中Dgcr8−/− ESCs没有生成成熟miRNA的能力。将MICR与荧光蛋白表达相偶联，利用荧光蛋白的表达情况反映MICR-ON是否可被相应miRNA激活。结果表明，RFP在V6.5 ESCs中表达，在Dgcr8−/− ESCs中无明显表达(图c)。说明，功能sgRNAs仅在表达miRNA的V6.5 ESCs中产生，即MICR可以被miRNA诱导开启。

3. MICR-ON系统特异性的验证

研究人员通过设计存在不同miRNA结合位点的pre-sgRNA，观察不同miRNA调控下RFP的表达情况，来验证MICR-ON系统是否对miRNA具有较高的特异性。从结果上来看，当pre-sgRNA互补的miRNA存在时，RFP表达，相应的miRNA部分碱基突变或缺失，都会影响RFP表达，甚至无法诱导sgRNA的产生。说明MICR-ON系统具有高度特异性。

4. MICR-ON-RFP报告了细胞分化过程中特定miRNA的活性

研究人员通过对细胞分化前后miRNA表达量与MICR偶联的RFP表达情况的相关性分析，证明了MICR-ON-RFP可以作为miRNA的报告基因来监测细胞分化过程中内源性miRNA表达或活性的变化。

5. MICR平台在细胞特异性miRNA诱导下调控细胞内源基因的表达或基因编辑

研究人员设计了miR17T-sgRNA-miR17T 和miR122T-sgRNA-miR122T两个pre-sgRNA以用来靶向human TTN的转录起始位点。然后，将dCas9-VPR和pre-sgRNA质粒转染到miR-17表达水平高但是miR-122表达水平低的HEK-293T细胞中(fig.4a)。结果显示，TTN含量在miR-17-sensing-CRISPR-on细胞中显著性增加，但在miR-122-sensing-CRISPR-on细胞中不表达，但当转染miR-122模拟物到HEK-293T细胞中后，TTN表达被激活(fig.4b)。这些数据表明，MICR平台可以在细胞特异性miRNA的诱导下开启，进而激活内源蛋白的表达。另外，当dCas9-VPR替换成融合转录抑制因子的dCas9-KRAB时，MICR可以在miRNA的诱导下抑制内源性基因表达。当将Cas9效应蛋白换成碱基编辑器(Base Editor)时，MICR可以在miRNA的诱导下精准编辑染色质上的精确位点。

6. MICR平台激活形式

在某些情况下，Cas9/dCas9系统的细胞类型特异性控制可能需要多个miRNA的输入，因此研究人员设计了存在两种由不同miRNA靶向的pre-sgRNA连接结构体(图a)，该结构体的可以靶向细胞中一种或多种目的基因，研究人员利用MICR平台激活荧光报告基因的表达这一形式，通过对添加miRNA模拟物后细胞中荧光蛋白表达量的测定(图b-f)，证实了该平台可以感知多个miRNA并对不同基因位点进行精准调控。另外，由于miRNA和siRNA切割RNA的机理相同，研究人员也验证了MICR也可以用作感知外源或内源siRNA的传感器(图g,h)。

研究结论

在这项研究中，研究人员成功设计了一个由细胞类型特异性miRNA或siRNAs激活CRISPR-Cas9平台(MICR)，包括MICR-ON(激活基因表达)、MICR-i（抑制基因表达）和MICR-BE（基因编辑器）系统，该平台一方面通过内源性或合成miRNAs诱导调控特定细胞中内源基因转录或介导DNA碱基编辑；另一方面，当利用荧光蛋白基因作为报告基因时，MICR-ON-荧光蛋白系统可以用来报告细胞类型特异性miRNA的活性，并跟踪细胞的分化状态。MICR的发明实现了对CRISPR基因编辑系统的精准控制，有望增强相关基因编辑技术在疾病治疗过程中的安全性和有效性，为合成生物学、基于基因编辑体系的基因治疗提供新的技术手段和思路。

参考文献：

Wang XW, Hu LF, Hao J, Liao LQ, Chiu YT, Shi M, Wang Y. (2019). A microRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform serves as a microRNA sensor and cell-type-specific genome regulation tool. Nat Cell Biol 21(4):522-530.

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